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支原體標準品的品控是保證質(zhì)量的關(guān)鍵

更新時間:2020-11-25  |  點擊率:808

生物制品和細胞治療企業(yè)已越來越多地采用核酸法進行支原體的檢查和生產(chǎn)質(zhì)控。核酸法如替代藥典方法,則需進行方法驗證。

現(xiàn)在一些地方在使用德國MB公司的支原體標準品或支原體基因組DNA(定量標準品),包括靈敏度標準品(10CFU,100CFU)、特異性標準品以及PCR定量標準品,其中靈敏度標準品也可用于耐用性的驗證。

MB廠家具有ISO 9001和ISO 13485質(zhì)量體系認證。每個批次支原體標準品都有驗證和質(zhì)控。同時支原體培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基每個批次都符合歐洲藥品質(zhì)量管理局(EDQM)的標準。標準品每個批次都提供有質(zhì)控證書(COA)。標準品所用的支原體菌株來自英國NCTC菌種保藏中心,同時具有相應(yīng)的ATCC編號。

下面對MB廠家的三類標準品的質(zhì)控方面做一介紹。

(一)支原體靈敏度標準品

10CFU支原體靈敏度標準品為滅活支原體,這樣不會對實驗室造成支原體污染。它用于核酸法的靈敏度和耐用性驗證。它每盒含3管10CFU支原體凍干粉,2管陰性對照。靈敏度標準品主要經(jīng)過下列三方面的質(zhì)控:

 

1. 功能檢測:

即標準品復(fù)溶后作DNA抽提(采用MB公司的Venor®GeM Sample Preparation Kit),再用符合藥典標準的qPCR試劑盒檢測,應(yīng)保證有擴增曲線。

2. 活力檢測:

即標準品在培養(yǎng)基中復(fù)溶并培養(yǎng)7天后,再進行DNA抽提和qPCR檢測,Ct值和對照組比,應(yīng)不超過允許閾值(ΔCt >2)。該檢測主要是確保支原體均已滅活。

3.di閾限檢測和批次合格標準:

標準品用DMEM+5%FCS進行10倍梯度稀釋,形成3個稀釋度,DNA抽提后然后進行前后3輪qPCR檢測,每輪每個稀釋度重復(fù)8次。每種支原體的Ct平均值應(yīng)達到一定標準,方為合格。

(二)支原體基因組DNA——特異性驗證用

該基因組DNA是從相應(yīng)的支原體中抽提出來,并制成凍干粉。每管為10ng左右。復(fù)溶時,每管加100ml廠家提供的Tris緩沖液,室溫靜置5分鐘,再渦旋離心5秒鐘。

廠家對基因組中的16S rRNA段進行了序列分析,要求應(yīng)與相應(yīng)支原體物種的同源性應(yīng)達到99%以上。對制備的DNA質(zhì)量和數(shù)量進行了熒光分析和PCR擴增。PCR擴增應(yīng)顯示為單一的擴增條帶。

(三)PCR定量標準品

每管為1x108拷貝的支原體物種基因組DNA凍干粉,使用時也是先用廠家提供的Tris緩沖液復(fù)溶。質(zhì)控時,對16S rRNA的部分序列進行測序分析,以鑒定支原體物種,測序結(jié)果應(yīng)顯示為99%以上的同源性。再對該標準品作系列梯度稀釋,再進行qPCR擴增,應(yīng)顯示為良好的線性。該方法還可確定qPCR方法的檢測閾值。

MB公司的上述三類標準品可用于對支原體核酸法的方法學(xué)驗證,包括靈敏度、特異性和耐用性。其中,基因組DNA除了包括常見支原體物種外,還包括一些常見細菌,用于驗證常規(guī)PCR或qPCR的檢測是否會產(chǎn)生交叉反應(yīng)。

總之,良好的質(zhì)控是標準品品質(zhì)的保證,這樣才能確保方法驗證結(jié)果的可靠性,使支原體的核酸法檢測符合藥典所規(guī)定的標準,從而為替代培養(yǎng)法等經(jīng)典支原體的檢測方法提供數(shù)據(jù)支持。

 

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