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支原體CCU計數(shù)法與CFU定量法的比較

更新時間:2020-12-10  |  點擊率:1719

在制藥和臨床領域,支原體定量是采用CCU計數(shù)法。即用“顏色改變單位(CCU) ”對支原體進行定量。該方法主要是將支原體菌液10倍系列稀釋,然后接種在含酚紅的支原體肉湯培養(yǎng)基中,36°C±1°C 培養(yǎng)714天。使培養(yǎng)基變色的highest菌液稀釋度定為1ccu/ml。

而在制藥領域,用PCR/qPCR方法對產(chǎn)品進行支原體檢查時,要求檢測方法的檢測限達到10CFU/ml。CFU即菌落形成單位,它代表著支原體在瓊脂培養(yǎng)基上的菌落數(shù)量,這是另外一種定量法。

這兩種定量法是否具有可比性?在20202月第4期的《衛(wèi)生檢驗雜志》上,一篇名為《支原體菌落形成單位與顏色改變單位定量關系研究》的論文報告了兩種方法比較的結果。

在該研究中,作者用A8培養(yǎng)基培養(yǎng)解脲支原體(ATCC 3317548小時,用支原體培養(yǎng)基培養(yǎng)人型支原體(ATCC 2311472小時,用SP4培養(yǎng)基培養(yǎng)肺炎支原體(ATCC 293426天,然而觀察菌落的生長情況。同時,作者將菌株凍干粉復溶后進行梯度稀釋,接種到相應肉湯中。為降低誤差,作者對菌液采取了5倍系列稀釋,而非10倍。當培養(yǎng)至肉湯顏色不再變化時,highest稀釋倍數(shù)的菌液濃度即為1ccu/ml,然后根據(jù)稀釋倍數(shù)回算出菌液原液的濃度。

在進行CFU計數(shù)時,作者發(fā)現(xiàn),典型支原體菌落的直徑是15mm~300mm。其中,人型支原體和肺炎支原體的菌落可以肉眼識別,而解脲支原體的菌落直徑只有15mm~60mm,需要借助低倍顯微鏡才能看到并計數(shù)。

作者重復了10次,結果顯示,對于這3株支原體,CCU計數(shù)較為穩(wěn)定,CFU計數(shù)則存在一定的波動。對于解脲支原體,CCUCFU二者的計量結果接近,無顯著差異;而對于人型支原體和肺炎支原體,CFU計量數(shù)值略高于CCU計量數(shù)值,有顯著差異。

由于支原體在肉湯生長比瓊脂中要快,因此實際工作中CCU計數(shù)更為常見。作者認為,解脲支原體菌落較小,不容易計數(shù),因而標準差較高。10倍稀釋對CCU計量的結果會造成一定誤差,因為實驗中培養(yǎng)基變色的highest稀釋度往往并不是能夠變色的highest稀釋度。降低稀釋倍數(shù)會減少誤差,但是會增加工作量。

在該實驗中,作者給出了三個菌株10次試驗的全部數(shù)據(jù),因而可對CCU計數(shù)與CFU定量的結果進行比較,明確二者之間的關系。

目前,在支原體檢查中,越來越多的藥廠采用PCRqPCR方法。但該方法用于放行檢測時,需要進行方法驗證,保證適用性。這是,常用到10CFUTM支原體靈敏度標準品。

 

對于制藥領域的支原體檢查,歐洲藥典規(guī)定,以PCR為代表的核酸擴增技術如果要替代培養(yǎng)法,其檢測限需至少達到10CFU/ml。

德國Minerva Biolabs公司(簡稱MB)提供有歐洲藥典規(guī)定的9種支原體的10CFUTM靈敏度標準品,經(jīng)過jign準標定,可用于PCR/qPCR的靈敏度驗證。

菌株均來自英國菌種保藏中心(NCTC),具有ATCC編號。

為避免給實驗室?guī)砦廴荆гw均經(jīng)過滅活,并且為凍干粉形式,4℃保存,性能穩(wěn)定。

每種支原體靈敏度標準品提供有CFUGC(基因組拷貝數(shù))的換算數(shù)值(詳見質(zhì)控證書)。

 

 

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