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干貨分享:細(xì)胞轉(zhuǎn)染全攻略(下)

更新時(shí)間:2022-06-01  |  點(diǎn)擊率:659

細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法對(duì)比,以及各類(lèi)方法的優(yōu)缺點(diǎn),我們都已介紹過(guò)了。

今天來(lái)到細(xì)胞轉(zhuǎn)染——技巧篇,談?wù)勅绾尾拍苓M(jìn)行高效地轉(zhuǎn)染。


轉(zhuǎn)染試劑的選擇

不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同,但細(xì)胞系的選擇通常是根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要,因此在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和細(xì)胞特性選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑。

每種轉(zhuǎn)染試劑都會(huì)提供一些已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株列表和文獻(xiàn),通過(guò)這些資料可選擇適合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)染試劑。當(dāng)然,適合的是高效、低毒、方便、廉價(jià)的轉(zhuǎn)染試劑。


細(xì)胞狀態(tài)

一般低的細(xì)胞代數(shù)(<50)能確保基因型不變。適合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是經(jīng)過(guò)幾次傳代后達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛,最容易轉(zhuǎn)染。

細(xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會(huì)經(jīng)歷突變,總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。也就是說(shuō)同一種系的細(xì)胞株,在各實(shí)驗(yàn)室不同培養(yǎng)條件下,其生物學(xué)性狀發(fā)生不同程度的改變,導(dǎo)致其轉(zhuǎn)染特性也發(fā)生變化。

因此,如果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率降低,可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)最佳結(jié)果。


轉(zhuǎn)染方法

轉(zhuǎn)染時(shí)應(yīng)根據(jù)具體轉(zhuǎn)染試劑推薦的方法進(jìn)行,但也要根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的條件來(lái)確定最佳轉(zhuǎn)染條件。
(1)細(xì)胞培養(yǎng)物

推薦在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)分細(xì)胞,這將提供正常細(xì)胞代謝,增加對(duì)外源DNA攝入的可能。一定要避免細(xì)菌,支原體或真菌的污染。

(2)細(xì)胞密度
細(xì)胞密度對(duì)轉(zhuǎn)染效率有一定的影響。如果選用新的細(xì)胞系或者新的轉(zhuǎn)染試劑,最好能夠進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)并為以后的實(shí)驗(yàn)建立一個(gè)穩(wěn)定方法,包括適當(dāng)?shù)慕臃N量和培養(yǎng)時(shí)間等等。

(3)血清
對(duì)于主流的轉(zhuǎn)染試劑來(lái)說(shuō),血清的存在不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率,甚至還有助于提高轉(zhuǎn)染效率。

不過(guò)要特別注意:對(duì)于RNA轉(zhuǎn)染,如何消除血清中潛在的RNase污染是值得關(guān)注的。

胎牛血清經(jīng)常用到,便宜一點(diǎn)的有馬或牛血清。通常的,血清是一種包含生長(zhǎng)因子及其它輔助因子的不確切成分的添加物,對(duì)不同細(xì)胞的生長(zhǎng)作用有很大的差別。血清質(zhì)量的變化直接影響細(xì)胞生長(zhǎng),因此也會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。新加培養(yǎng)基的預(yù)熱對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染很有幫助。

(4)氮磷(N/P)比
N/P比是轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵(為了換算方便,一般以DNA/轉(zhuǎn)染試劑質(zhì)量比表示),在一定比例范圍內(nèi)轉(zhuǎn)染效率隨N/P比成比例增高,之后達(dá)到平值,但毒性也隨之而增加,因此在實(shí)驗(yàn)之前應(yīng)根據(jù)推薦比例,確定本實(shí)驗(yàn)的最佳轉(zhuǎn)染比例。
(5)DNA質(zhì)量
DNA質(zhì)量對(duì)轉(zhuǎn)染效率影響非常大。應(yīng)盡可能提高DNA的純度。


載體構(gòu)建

轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建(病毒載體,質(zhì)粒DNA,RNA,PCR產(chǎn)物,寡核苷酸等)也影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。

病毒載體對(duì)特定宿主細(xì)胞感染效率較高,但不同病毒載體有其特定的宿主,有的還要求特定的細(xì)胞周期,如逆轉(zhuǎn)錄病毒需侵染分裂期的宿主細(xì)胞,此外還需考慮一些安全問(wèn)題(如基因污染)。

除載體構(gòu)建外,載體的形態(tài)及大小對(duì)轉(zhuǎn)染效率也有不同的影響,如前面提到的超螺旋及線性DNA對(duì)瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的影響。如果基因產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有毒性作用,轉(zhuǎn)染也很難進(jìn)行,因此選擇組成或可調(diào)控,強(qiáng)度合適的啟動(dòng)子也很重要,同時(shí)做空載體及其它基因的相同載體構(gòu)建的轉(zhuǎn)染正對(duì)照可排除毒性影響的干擾。

血清在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的重要性不言而喻:

  • 提供對(duì)維持細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)的激素,基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒(méi)有或量很少的營(yíng)養(yǎng)物,以及主要的低分子營(yíng)養(yǎng)物。

  • 提供結(jié)合蛋白,能識(shí)別維生素、脂類(lèi)、金屬和其他激素等,能結(jié)合或調(diào)節(jié)它們所結(jié)合的物質(zhì)活力。

  • 有些情況下結(jié)合蛋白質(zhì)能與有毒金屬和熱原質(zhì)結(jié)合,起到解毒作用。

  • 是細(xì)胞貼壁、鋪展在塑料培養(yǎng)基質(zhì)上所需因子來(lái)源。

  • 起酸堿度緩沖液作用。

  • 提供蛋白酶抑制劑,使在細(xì)胞傳代時(shí)使剩余胰蛋白酶失活,保護(hù)細(xì)胞不受傷害。

  • 參與細(xì)胞凍存。

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