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支原體檢測方法有哪些?

更新時間:2022-08-18  |  點擊率:704

支原體對細胞培養(yǎng)會帶來嚴(yán)重的危害,同時,它的發(fā)生率較高,肉眼不易察覺。有報道,在細胞培養(yǎng)室中,它的平均發(fā)生率甚至可高達63%。在生物制品中,它的發(fā)生率為1%~3%。

污染細胞的支原體主要有五個方面的可能來源:

1. 環(huán)境

2. 被污染的細胞

3. 人體表面的攜帶(如口腔、鼻腔、皮膚等)

4. 實驗試劑,如培養(yǎng)基、胰酶等

5. 未*消毒的實驗器具

傳統(tǒng)的支原體檢測方法有哪些呢?

方法一:培養(yǎng)法。直接將待測樣品涂布在支原體液體或固體培養(yǎng)基上,讓其生長,一般需要數(shù)周,才能看到菌液變渾濁或有菌落長出。 培養(yǎng)法是支原體檢測經(jīng)典的方法,其優(yōu)點是:靈敏度適中和結(jié)果可靠。但是培養(yǎng)法的一個主要缺點是時間周期太長,不適合作為細胞污染的快速檢測方法。

方法二:DNA的熒光染色法。熒光染劑(如Hoechst 33258,DAPI)可以結(jié)合到細胞和支原體的DNA。被支原體污染的細胞經(jīng)染色后,如果在細胞核外與細胞周圍可看到許多大小均一之熒光小點,即為支原體的DNA,則證明有支原體之污染。該法相對培養(yǎng)法快速,但是靈敏度較差。當(dāng)用熒光染色法發(fā)現(xiàn)有支原體后,支原體的清除相對就較困難。

方法三:掃描電鏡法。將細胞樣品進行掃描電鏡拍照,如果被支原體污染可以在細胞表面看到密密麻麻的小顆粒。該方法由于要使用電子顯微鏡,不適合用作實驗室常規(guī)檢測。

方法四:PCR法。PCR法相對較快,靈敏度也較高。是目前實驗室常用的支原體檢測方法。但是PCR法也有自己的致命缺點:細胞培養(yǎng)液上清常含有強烈抑制PCR擴增的代謝產(chǎn)物。因為很多研究人員直接使用細胞培養(yǎng)液上清原液進行PCR檢測,如果檢測為陰性就認為沒有支原體污染。其實,還有一種可能性,就是PCR的擴增被細胞的代謝產(chǎn)物抑制了,而不是沒有支原體污染!

通常來說,被污染的細胞應(yīng)該丟棄,以避免成為污染源。但對于珍貴的細胞,以往別的品牌的支原體清除劑,其實只是抑制劑,它們抑制支原體的DNA合成和蛋白合成,但無法殺除。Mynox®是市面上一款具有殺滅作用的清除劑。它提取自枯草桿菌,可與支原體膜特異性結(jié)合,破壞膜通透性,導(dǎo)致支原體膨脹破裂而死。


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