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帶您了解RT-PCR引物/探針

更新時(shí)間:2022-11-17  |  點(diǎn)擊率:1053

一、產(chǎn)品用途:

RT-PCR引物/探針(英文名:SARS-CoV-2 Confirm),用于定性檢測(cè)和分析新guan病毒RNA。它僅用于研究,不用于臨床診斷。

二、產(chǎn)品描述:

1.該產(chǎn)品包括三個(gè)小管:

①橙蓋:  Mix(凍干粉),1管。

此管為新guan病毒引物/探針,可特異性擴(kuò)增新guan病毒的RdRp基因(即RNA依賴性RNA聚合酶基因),而其他冠狀病毒RNA不會(huì)被檢測(cè)到【1】【2】。(該引物/探針依據(jù)WHO診斷參考實(shí)驗(yàn)室公布的新guan病毒引物/探針序列而設(shè)計(jì)【1】。更多詳情可訪問(wèn)


如要檢測(cè)其他冠狀病毒,推薦MB公司提供的其他冠狀病毒引物/探針,品名:CoV Screen (without ConviFlex™ RT-Taq Mix),貨號(hào):271-1100。

②綠蓋: Positive Control RNA(陽(yáng)性對(duì)照RNA,凍干粉),1管。

此陽(yáng)性對(duì)照RNA為一段合成的RNA序列(序列來(lái)自武漢的病毒株)。

③白蓋: PCR Grade Water(液體),1管。

2.使用前,①橙蓋和②綠蓋先用PCR級(jí)水(③白蓋)復(fù)溶,并分裝,避免反復(fù)凍融。

3.該引物/探針應(yīng)與MB公司提供的【RNA病毒檢測(cè)試劑盒】(英文名:ConviFlex™RT-Taq Mix,

貨號(hào)192-0025/-0100/-0250)一起使用,用于新guan病毒RT-qPCR反應(yīng)檢測(cè)。

4.檢測(cè)樣本需為抽提過(guò)的RNA樣本。

5.新guan病毒的靶基因RdRp是用FAM™通道檢測(cè),擴(kuò)增的人RNA酶P基因(過(guò)程對(duì)照)用ROX™通道檢測(cè),用以評(píng)估樣本的制備質(zhì)量。

三、產(chǎn)品特點(diǎn):

1.靶點(diǎn)特別。依據(jù)WHO國(guó)際標(biāo)準(zhǔn),此引物探針為新guan病毒RdRp基因,而非市面上常見(jiàn)的ORF1ab和N基因或E基因。

2.陽(yáng)性對(duì)照RNA為一段合成的RNA序列(序列來(lái)自武漢的病毒株)。

3.主要組分為凍干粉,4℃保存,儲(chǔ)存運(yùn)輸方便,性能穩(wěn)定。

4.適用于科研中,各種來(lái)源的RNA樣本,包括拭子、活檢組織、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌等。

四、需用戶自己準(zhǔn)備的試劑耗材和儀器:

1.RNA病毒檢測(cè)試劑盒(RT-qPCR法)(英文名:ConviFlex™ RT-Taq Mix,貨號(hào)192-0025/-0100/-0250)

2.熒光定量PCR儀(qPCR儀)

3.無(wú)DNase和RNase的qPCR反應(yīng)管

4.離心機(jī)

5.移液器及帶濾芯吸頭(不含DNase和RNase)

6.用戶自己提取的RNA或現(xiàn)成的RNA樣品。(抽提過(guò)程建議使用商品化的RNA提取試劑盒完成,如MB廠家的:

【病毒RNA提取試劑盒】(ExtractNow™ Virus RNA Kit,貨號(hào)611-1010/-1050/-1250)

或【病毒RNA拭子提取試劑盒】(ExtractNow™ Virus RNA Swab Kit,貨號(hào)611-2250)。

五、操作注意事項(xiàng):

該引物/探針應(yīng)僅由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)室人員使用。

始終穿上合適的防護(hù)服和戴一次性手套。

根據(jù)樣品類型,應(yīng)謹(jǐn)慎處理所有樣品。請(qǐng)遵循WHO推薦的方法處理樣本。

該試劑盒不含有害物質(zhì)。 殘余物可以根據(jù)當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)丟棄。

六、操作步驟:

步驟1. 試劑制備

①橙蓋Mix引物探針凍干粉,最大速離心5秒鐘,加入525lPCR級(jí)水(白蓋),室溫靜置5分鐘后,渦旋并離心5秒鐘,分裝,待用或-18℃保存。

②綠蓋Positive Control RNA陽(yáng)性對(duì)照凍干粉,最大速離心5秒鐘,加入105lPCR級(jí)水(白蓋),室溫靜置5分鐘后,渦旋并離心5秒鐘,分裝,待用或-18℃保存。

步驟2. RT-qPCR引物/探針mix制備(20μl反應(yīng)體積)

(1)1個(gè)反應(yīng)需要加入:酶預(yù)混液 (自備的紅蓋預(yù)混液)10l ,

橙蓋(復(fù)溶的Mix引物/探針)5l

(紅蓋預(yù)混液 來(lái)自MB公司的【RNA病毒檢測(cè)試劑盒】(RT-qPCR法),

英文名:ConviFlexRT-Taq Mix, 貨號(hào)192-0025/-0100/-0250,需單獨(dú)購(gòu)買)

(2)將以上引物/探針mix渦旋混勻,并離心5秒鐘。

(3)每個(gè)PCR管中加入15μl上述引物/探針mix和5μl樣本(抽提后的RNA),

或5μl RNA提取試劑盒中的洗脫緩沖液,作為陰性對(duì)照,或5μl PCR級(jí)水作為無(wú)模板對(duì)照,或5μl陽(yáng)性對(duì)照RNA。

(4)緊扣PCR管,然后短暫離心。

(5)將PCR管放置qPCR儀上,緊上頂蓋。

步驟3. 設(shè)置qPCR程序

1個(gè)循環(huán): 55 ℃,10分鐘

1個(gè)循環(huán): 94 ℃,3 分鐘

45個(gè)循環(huán):94 ℃,15秒

58℃,30秒

步驟4. 啟動(dòng)程序

七、使用注意事項(xiàng):

1.使用前應(yīng)認(rèn)真閱讀說(shuō)明書(shū)。

2.來(lái)自不同批次的試劑不能混合。

3.試劑盒內(nèi)的試劑應(yīng)始終作為一個(gè)整體溶解分裝。

4.試劑盒應(yīng)在效期內(nèi)使用。

5.每次PCR至少應(yīng)設(shè)置一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照。每次PCR至少應(yīng)設(shè)置一個(gè)陰性對(duì)照和/或一個(gè)無(wú)模板對(duì)照。如果實(shí)驗(yàn)者自己抽提RNA,則可使用洗脫緩沖液作為陰性對(duì)照。對(duì)照必須與待測(cè)樣品的處理方式相同。您也可能需要其他實(shí)驗(yàn)室提供的對(duì)照品,例如含高、中、低不同濃度的RNA樣品。使用對(duì)照,對(duì)于確認(rèn)結(jié)果的可靠性或用于排除故障非常有意義。

6.建議在無(wú)RNA和DNA污染的條件下進(jìn)行RT-PCR,以避免操作過(guò)程中DNA或非特異RNA的交叉污染。(MB公司推薦使用PCR污染祛除噴霧,英文名:PCR Clean™,貨號(hào)15-2025,預(yù)先清潔實(shí)驗(yàn)環(huán)境。)

7.盡量減少RNA樣品的凍融次數(shù),同時(shí)避免RNA酶污染,以減少RNA降解的風(fēng)險(xiǎn)。(RNA降解會(huì)極大地限制了RT-qPCR反應(yīng)的性能)。請(qǐng)確保高質(zhì)量的完整RNA用于檢測(cè)。

8.樣本制備過(guò)程中,注意避免其他DNA的污染,DNA的干擾也會(huì)降低qPCR的準(zhǔn)確性。


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