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為什么不建議用指示細(xì)胞培養(yǎng)法來檢測支原體?

更新時間:2023-11-05  |  點擊率:471

指示細(xì)胞培養(yǎng)法又稱為指示細(xì)胞法、DNA染色法,該方法的實驗思路是:

培養(yǎng)指示細(xì)胞-樣品上清液收集-上清液接種-染色觀察結(jié)果

 

具體包含以下幾個步驟:

 

將供試品接種于指示細(xì)胞(無污染的Vero 細(xì)胞或經(jīng)國家藥品檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可的其他細(xì)胞,供試品應(yīng)對該細(xì)胞生長無影響。下面以Vero細(xì)胞為例)中培養(yǎng)后,用特異熒光染料(如Hoechst 33258)染色,支原體中的核酸也可以被著色,因此,如果待檢測細(xì)胞中含有支原體,那么就會導(dǎo)致指示細(xì)胞被感染,進(jìn)而在細(xì)胞膜或培養(yǎng)基等處發(fā)現(xiàn)藍(lán)色熒光(支原體附著在細(xì)胞膜上,也有可能游離在細(xì)胞培養(yǎng)基中)。

 

指示細(xì)胞培養(yǎng):將指示細(xì)胞復(fù)蘇、傳代,調(diào)整至最佳狀態(tài),留出適宜的量備用。

 

樣品上清液收集:無抗生素培養(yǎng)基中加入待檢測樣品后,細(xì)胞需至少傳一代,然后取細(xì)胞已長滿且3 天未換液的細(xì)胞培養(yǎng)上清液待檢。(為了對待檢測樣品中的支原體進(jìn)行富集)

 

上清液接種:在制備好的指示細(xì)胞培養(yǎng)板中加入一定量的待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清,36°C培養(yǎng)3-5 天。指示細(xì)胞培養(yǎng)物至少傳代1 次,末次傳代培養(yǎng)可用6孔板培養(yǎng)3-5 天。

 

染色觀察:吸出培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液,加入固定液,放置5分鐘。吸出固定液后進(jìn)行10min的二次固定,再次吸出固定液,使蓋玻片在空氣中干燥。加DNA 染料工作液5ml,加蓋,室溫放置30分鐘,漂洗3次,干燥,封片。用熒光顯微鏡觀察。

 

熒光顯微鏡下可見細(xì)胞表面或培養(yǎng)基中,有大小不等、不規(guī)則的藍(lán)色熒光著色顆粒,則說明有可能存在支原體污染。

 

對于DNA染色法方法,優(yōu)缺點很明顯的:

優(yōu)點:

1、適用于一些不易培養(yǎng)的支原體,如豬鼻支原體,分離培養(yǎng)法對該支原體檢測并不可靠,但可用DNA染色法準(zhǔn)確地檢測出來。

2、操作步驟雖然多,但都相對簡單

3、靈敏度尚可。

 

缺點:

1、時間較長,從Vero細(xì)胞復(fù)蘇、傳代,再到收集上清后再次培養(yǎng),有時甚至需要十幾天時間

2、存在假陽性和假陰性的可能:如一些死亡細(xì)胞釋放出來的DNA會被染成藍(lán)色,出現(xiàn)假陽性;或是由于熒光過若而出現(xiàn)假陰性使結(jié)果出現(xiàn)偏差,因此使用這個方法需要一定的經(jīng)驗。


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